EXPERIMENTAL WORKFLOW / 实验流程
五个分析模块，
构成可复核的完整证据链。
沿着“鉴定—扩张—结构—选择—功能”的顺序浏览。每个模块同时标明输入、工具、关键产物和支撑结论。
GENE DISCOVERY
P450 基因鉴定流程
从官方基因集和同源证据出发，通过结构域验证与两轮基因模型修正，构建标准化高可信 P450 数据集。
Fig. 1 · 1,258 个 P450 的系统发育分类与物种组成。核心工具
关键结果
- 12 个物种
- 1,258 个完整 P450
- >350 aa + PF00067
- David Nelson 命名校正
方法检查点 ＋
候选需同时满足序列长度、同源命中和 PF00067 结构域证据；BITACORA/GeMoMa 补预测结果需回查基因模型。
EVOLUTIONARY EXPANSION
P450 家族扩张与进化分析
以 Orthogroup、基因树和物种树为三条互补证据，识别夜蛾科特异扩张并重建获得/丢失历史。
Fig. 2 · 基因获得/丢失事件与 Orthogroup 拷贝数热图。核心工具
关键结果
- 夜蛾科祖先约 105 个 P450
- 相对共同祖先净增 20 个
- OG1–OG5 显著富集
- CYP3/CYP4 主导扩张
方法检查点 ＋
OrthoFinder 数量、比对序列数与树叶节点必须一致；普通比对与 HMM-guided 结果需比较保守位点和缺口比例。
GENOMIC ARCHITECTURE
基因组结构与扩张机制解析
将 P450 重新放回染色体坐标，结合串联阵列、微共线性和局部 TE 景观，定位保守扩张热点。
Fig. 3 · 串联阵列分布以及 Locus 1/2 的跨物种微共线性。核心工具
关键结果
- 795 个基因位于 TA
- 最大阵列 20 个基因
- Locus 1 · CYP4/OG1
- Locus 2 · CYP3/OG3
方法检查点 ＋
串联阵列定义为无非 P450 基因打断且相距 5 kb 内；所有共线性连线必须回溯到统一 ID 与坐标版本。
MECHANISM SPLIT
TE 动力学揭示位点分化
Locus 1：夜蛾科局部 TE 显著富集（P=0.041），且与 P450 拷贝数高度相关（R²=0.8588）。
Locus 2：TE 富集通常低于全基因组背景，拷贝数与 TE 不相关，提示扩张后的结构稳定化。
ADAPTIVE EVOLUTION
适应性进化与选择压力分析
利用密码子感知比对和多层次 HyPhy 模型，判断扩张基因簇是否经历间歇性正选择、分支特异选择及选择强度改变。
Fig. 5 · 两个扩张位点的 aBSREL 分支选择压力分析。核心工具
关键结果
- Locus 1 BUSTED P=0.00018
- Locus 2 P=3.02×10⁻⁷
- aBSREL 定位正选择分支
- RELAX: K₁=6.32 / K₂=1.00
方法检查点 ＋
蛋白比对与 CDS 映射需一一对应；BUSTED、aBSREL 和 RELAX 分别回答不同层级的选择问题，不能互相替代。
FUNCTIONAL RESPONSE
功能验证与表达响应分析
将扩张 P450 与已验证功能参照序列建树，并整合杀虫剂胁迫转录组，检验两个位点的功能偏向和调控策略。
Fig. 6 · 功能参照树与两个位点在杀虫剂胁迫下的表达响应。核心工具
关键结果
- 10 种杀虫剂
- LC25 + LC50
- Locus 2 协同表达
- Locus 1 异质响应
方法检查点 ＋
42 个样本需按研究、剂量和处理条件分层；差异标准为 Fold change > 2 且 adjusted P < 0.05。
SYNTHESIS
结构产生可塑性，选择与调控决定其去向。
五个模块最终汇聚为一个机制模型：古老的保守位点提供扩张框架，串联复制与局部 TE 环境创造变异，选择压力与表达调控将冗余拷贝塑造成剂量效应或功能特化。
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